PAS染色操作简单，仅需6步。但你的片子为什么会“整张的淡红色看不到糖原呢”或者“满满的紫红色，根本找不到细胞核”？
这就需要我们洞察PAS染色的核心原理和操作细节了。「IHC急救室」第20篇，我们将会对PAS染色原理、操作关键参数、应用场景及不同组织的特殊要求进行汇总分析，助你获得精准染色结果。
PAS染色（Periodic Acid-Schiff stain），即过碘酸-雪夫染色、糖原染色，是组织化学或病理特殊染色中经典的方法之一。该方法最早由McManus于1946年用于显示黏蛋白，后来被广泛用于糖原检测。除此之外，PAS还用于基底膜、软骨基质、真菌细胞壁、阿米巴滋养体等染色。
PAS染色主要涉及3种化学反应：
1）氧化：过碘酸（HIO4）将糖原分子中相邻两个碳上的羟基（-OH）氧化为醛基（-CHO）。
2）显色：Schiff试剂（无色品红）与新生成的醛基反应，形成紫红色/洋红色复合物。
3）复染：苏木素将细胞核染成蓝色。
因此，PAS染色的最终结果为：
· 糖原、黏蛋白、基底膜等：紫红色
· 细胞核：蓝色
· 肌纤维、红细胞：红色
正常肾（NK）和慢性肾病（CKD）组织的PAS染色结果（源自文献：George SK, et al. Potential Use of Autologous Renal Cells from Diseased Kidneys for the Treatment of Renal Failure）
特别提醒：PAS阳性并不等于含糖量高。因为除了糖原，这些物质也会呈现阳性：
PAS阳性物质 | 常见组织 |
糖原 | 肝细胞、肌细胞 |
中性黏蛋白 | 腺体分泌的黏液 |
基底膜 | 肾小球、血管壁 |
软骨基质 | 软骨组织 |
真菌细胞壁 | 隐球菌、念珠菌等 |
糖蛋白 | 多种细胞表面和分泌产物 |
常规PAS染色无法区分糖原与其他多糖物质。为解决这一问题，D-PAS染色（淀粉酶消化PAS染色）应运而生，可实现糖原的特异性检测。
在PAS染色前，用淀粉酶对组织切片进行处理。淀粉酶能水解糖原的α-1,4糖苷键结构，将其分解为水溶性的麦芽糖，从而将其从组织中去除。经淀粉酶消化后的切片再进行PAS染色，原糖原占据的区域不着色，其余不被淀粉酶消化的阳性物质则正常显示，以此确定切片中的紫红色是否为糖原着色。
选取两张连续的切片。其中一张作为对照组，直接进行常规PAS染色，另一张作为实验组，先用淀粉酶溶液消化处理，37℃孵育30-60分钟，再进行常规PAS染色。最后在显微镜下对比观察两张切片。
若对照组呈紫红色，而实验组对应区域颜色消失，则判断组织中存在糖原。若两张切片的染色结果一致，则说明组织中不含糖原。
黏膜上皮细胞分泌的黏液分为中性黏液和酸性黏液，如何精准区分二者？PAS染色结合AB（阿利新蓝）可实现。AB-PAS将酸性黏液染成蓝色，中性黏液染成红色，同时含有酸性和中性成分的混合型黏液会呈现紫蓝色或蓝紫色。其常用于胃癌分型和肠上皮化生诊断。
切片在脱蜡水化后，先用pH 2.5的阿利新蓝染色15-20分钟，水洗后进行常规PAS染色。
4例肺腺癌患者的三种黏液染色结果对比图（源自文献：Patrick Micke, et al. Mucin staining is of limited value in addition to basic immunohistochemical analyses in the diagnostics of non-small cell lung cancer）
PAS染色的应用范围越来越广泛。其可将组织中的黏多糖物质染成紫红色，用于判断肿瘤组织是否分泌糖原及推断肿瘤细胞的起源或是否发生血管浸润。PAS对真菌特异性强、着色鲜艳，是常用的真菌病诊断方法。PAS还用于观察心血管疾病缺血缺氧早期的心肌坏死或梗死区的糖原减少、支气管黏膜的杯状细胞检测、鉴别细胞内的空泡状变性等。
应用领域 | 染色结果 | 相关疾病 |
肾脏病理 | 基底膜、系膜基质、糖蛋白呈紫红色，显示肾小球基底膜增厚、系膜基质增多 | 膜性肾病、IgA肾病、糖尿病肾病、肾小球硬化 |
肝脏病理 | 糖原呈紫红色，显示肝细胞内糖原颗粒分布，评估肝糖原代谢 | 糖原贮积病、糖原性肝病 |
心血管 | 观察血管基底膜增厚、心肌糖原变化 | 糖尿病视网膜病、心肌病 |
血液系统 | 重点关注糖原的分布形态，急性淋巴细胞白血病呈粗大块状，急性粒细胞白血病呈弥散状 | 白血病 |
肿瘤病理 | 显示肿瘤细胞分泌的黏液/糖蛋白 | 辅助胃印戒细胞癌、肺黏液表皮样癌等诊断 |
真菌感染 | 细胞壁富含多糖，染成粉红/紫红色 | 隐球菌、念珠菌、曲霉菌 |
不同组织的结构特性存在差异，进行PAS染色时需针对性调整操作参数，才能获得精准、清晰的染色结果，具体特殊要求如下：
· 肾脏组织：切片需比常规的薄（2-3μm），避免厚切片造成基底膜结构重叠，影响结果。为获得稳定的细胞核染色及清晰的基底膜轮廓，建议用天青石蓝-苏木素进行核染。PAS染色是肾活检的常用技术，需重点观察肾小球基底膜厚度、系膜基质、系膜细胞形态。
· 肝脏组织：因含有大量糖原，推荐用Carnoy液进行固定，同时需设置淀粉酶消化对照，以排除其他PAS阳性物质的干扰。染色后重点观察肝细胞内的糖原颗粒分布、数量及形态。
· 骨髓或血液涂片：可用95%乙醇固定5分钟，因细胞层较薄，过碘酸氧化时间可缩短至5分钟，Schiff染色时间与石蜡切片基本一样。染色结果重点观察糖原形态。
· 真菌组织：细胞壁多糖且致密，氧化时间可延长至10-15分钟，确保氧化充分。多糖不是糖原，不需要做淀粉酶对照。可同时做GMS六胺银染色，进一步提高染色对比度。
总之，PAS染色常用于糖原及多糖物质的检测，操作流程简便。我们在实验过程中，遇到切片呈均匀淡红而没有糖原信号时，不要惊慌。我们可以对着实验记录本和关键试剂的配制日期或开封日期，进行系统溯源，抠每一个细节，比如氧化环节是否充分、试剂是否失效、酸性分化步骤是否过度、阳性和阴性对照设置是否规范等。
