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质谱技术的历史可以追溯到19 世纪初，英国科学家 J.J.Thomson 最早通过质量分离出氖同位素，而所用仪器就是第一台质谱仪。进入 20 世纪，质谱仪因其灵敏度高、特异性强、分析速度快等优点而逐渐被广泛应用。接下来跟小析姐一起来学习质谱知识吧。
质谱仪质谱仪发明于1912年，经过不断的发展，现如今检测限值，检测速度和适用性都有了极大的提升。质谱仪的原理是利用分子的基本特性（如质量和净电荷）来检测肽（或其他生物分子，如代谢物、脂质和蛋白质）的存在和丰度。当肽获得净电荷时（通常是通过获得质子），它们被称为肽离子。●进样系统：负责将待分析的样品导入质谱仪中，这一过程可以在不降低真空度的情况下进行。●真空系统：确保离子源、质量分析器、检测器等部件处于高真空状态，这对于保证质谱仪的准确性和稳定性至关重要。●离子源：将样品转化为带电粒子（正离子或负离子），同时具有聚焦和给离子提供初始动能的作用。●质量分析器：负责将离子按质荷比分开，使不同质荷比的离子得以分离，并送入检测器进行分析。●离子检测器：接收并检测不同质荷比的离子，并将其转换为可读出的信号。●数据处理系统：对检测到的信号进行记录、处理和显示，以提供对样品成分的详细分析结果。一般来说，所有的质谱仪都有三个基本组成部分：离子源、质量分析仪和检测器。由于质谱仪只能分析气态离子，因此需要使用电喷雾电离（ESI）等方法将肽从液相转化为气态离子。含有肽的液体被泵送通过一个微米大小的高压孔（2-4千伏）。在到达这个发射器后，稳定的液体流被分解成极小的、高电荷的、快速蒸发的带电液滴，在气相中留下肽离子。气态肽离子的丰度直接反映了原始蛋白质的浓度，因此，采用尽可能低的流速能更有效地提升检测灵敏度。在蛋白质组学研究中，高效液相色谱（HPLC）常被用于肽混合物的分离，其流速精细控制在每分钟几百纳升，远优于传统HPLC的流速，从而确保更精准的检测结果。质谱仪中质量分析器的主要作用是依据离子的质荷比（m/z）分离离子。从根本上来说，所有离子都是通过调节它们在电场中的轨迹来分离的。质量分析器在分离离子时采用的原理各不相同，这决定了它们各自的应用领域。在蛋白质组学中，四极杆质量分析器是常见的分析设备，它通常与时间飞行（TOF）或Orbitrap分析器结合使用。四极杆质量分析器的工作原理基于在四根平行排列的圆柱形杆之间施加振荡电场，每对杆都会产生一个具有相位偏移的射频电场。这些电场共同塑造了一个伪势表面，该表面经过配置后能够允许所有离子通过，或者选择性地仅让特定质荷比窗口内的离子通过，从而实现离子的有效分离。具有相同动能、不同质量的离子，因飞行速度不同而实现分离。当飞行距离一定时，离子飞行需要的时间与质荷比的平方根成正比，质量小的离子在较短时间到达检测器。为了测定飞行时间，将离子以不连续的组引入质量分析器，以明确起始飞行时间。离子组可以由脉冲式离子化(如基质辅助激光解吸离子化)产生，也可通过门控系统将连续产生的离子流在给定时间引入飞行管。飞行时间分析器的质量分析上限约15000道尔顿、离子传输效率高(尤其是质谱图获取速度快)、质量分辨率>104。轨道阱（Orbitrap）利用直流电场将离子局限于阱中，并运用傅里叶变换技术将时域信号转换到频域，再经换算得到离子的质荷比信号。离子被局限在固定的轨道内长时间高速周期运动，因此可获得数十万甚至上百万的高分辨率。在获得与FT-ICR近似分辨率性能的同时，Orbitrap不使用强磁场而使用直流电场，使用简单、维护成本低，是近年来质谱领域的重大突破。1923年，Kingdon发明了一个称为Kingdon Trap的离子捕集装置。该装置不使用任何磁场或高频电场，仅使用静电场捕集离子。用于捕集离子的静电场是由一个作为外电极的金属圆筒和一条作为中心电极的细铜线构成。在两个电极之间施以直流电压，即可建立一个以中心电极为轴心的非线性对数电场。离子可沿轴线运动、稳定且不会撞壁，但却无法沿轴向引出。受到Kindon Trap启发，俄罗斯的Markarov发明了Orbitrap，1999年在ASMS首次发表时分辨率达15万。Markarov后加入赛默飞公司，第一台商品化的LTQ-Orbitrap串联质谱仪于2005年推出。Orbitrap的势能场包括四极势能场和对数形的柱状电容场，形成纺锤状的中心电极，再搭配围绕中心电极的左右两个外围电极。离子在 Orbitrap内飞行，受到中心静电场的引力，围绕中心纺锤形电极做圆周轨道运动，路径似缠绕在纺锤上的纺线。被捕集到的离子在纺锤形电场中的运动轨迹是一个复杂的螺旋形，有径向、轴向和回旋三种运动，但只有轴向振荡频率ωz可用于质量分析，因为它完全独立于离子的能量以及空间分布。由于离子于轨道内像行星（如地球）绕行恒星（如太阳）一样进行简谐振动，所以这种质量分析器定名为轨道阱（Orbitrap）。首先，质谱仪会利用四极杆或其他离子分离装置，将具有特定质荷比（m/z）的前体离子进行分离。随后，这些离子会在碰撞室中与惰性气体（如N2、He或Ar）发生碰撞，进而破碎。在碰撞过程中，离子主要在最低能量键上断裂，通常是连接氨基酸残基的一些酰胺键（肽键）。这一过程会使MS/MS光谱产生不同的峰梯，峰之间的差异反映了氨基酸的质量。这些峰梯信息具有极高的特异性，是肽序列鉴定的关键所在。通过深入分析这些氨基酸的序列以及它们两侧的质量（肽序列标签），我们就能够从人类蛋白质组中识别出特定的肽。在实际应用中，更常见的是借助数据库识别，数据库中包含了所有可能生成的碎片谱图，将其与实验谱图进行对比进行统计评分，从而实现肽的准确鉴定。色谱保留时间是数据集与先前测量结果匹配时的重要信息，也是“靶向蛋白质组学”技术的关键。此外，离子迁移率分析作为肽离子分离的另一个维度，近年来逐渐被广泛应用最。离子可以根据其横截面进行过滤（FAIMS，场不对称离子迁移率谱法），或在分析过程中实际分离（T-Wave或TIMS，阱离子迁移率谱法）。TIMS是并行累积-串行碎片化（PASEF）技术的基础，该技术在提高灵敏度的同时将测序速度提高了10倍。质谱是有机化合物鉴定的有力工具之一，包括相对分子质量测定、化学式确定及结构鉴定等。从分子离子峰的质荷比可以准确地测定其相对分子质量。理论上可认为除同位素峰外，分子离子峰应该是最高质量处的峰，但有时由于分子离子的稳定性差而观察不到分子离子峰。在纯样品质谱中，分子离子峰应具有以下性质:（1）原则上除同位素峰外，分子离子峰是最高质量的峰。但某些样品会形成质子化离子峰及缔合离子峰。下图是样品可能会形成的加合离子。在ESI源条件下，双电荷离子如(M+2H)2+，(M-2H)2-和二聚体离子如(2M+H)+，(2M+HCOO)-也经常被观测到。（2）符合氮规则：在只含C、H、O、N的化合物中，不含或含偶数个氮原子的分子的质量数为偶数，含有奇数个氮原子的分子的质量数为奇数。这是因为在由C、H、O、N、P、卤素等元素组成的有机分子中，只有氮原子的化合价为奇数而质量数为偶数。（3）存在合理的碎片丢失。有机分子经离子化后，分子离子可能丢失一个H或CH3、H2O、C2H4等碎片，相应会出现M-1、M-15、M-18、M-28的碎片峰。（1）高分辨的质谱仪可以精确地测定分子离子或碎片离子的质荷比，则可利用化合物的确切质量推算出其元素组成。如CO与N2，两者的质量数都是28，但两者确切质量为27.9949与28.0061，若质谱仪测得的质荷比为28.0040，则可推断其为N2。（2）有些元素具有天然存在的稳定同位素，所以在质谱图上出现一些M+1、M+2的峰，由这些同位素形成的离子峰称为同位素离子峰。对于碳原子来说，12C的天然丰度为98.9%，13C的天然丰度为1.07%，从M+1峰与M峰强度的比值，可估算出分子中含碳的数目，碳原子的数目上限＝I(M+1)/I(M)÷1.1％，式中I(M+1)和I(M)分别表示M+1峰和M峰的强度。因此，含有一个碳原子的化合物如甲烷，M=17 与M=16的峰强度之比应该为0.011.其他元素也有同样的规律，含有一个氯原子的化合物中，I(M+2)/I(M)=32.5%，而在含有一个溴原子的化合物中，I(M+2)/I(M)=1.对于含有C、Br、Cl等同位素天然丰度较高的元素的化合物，其同位素离子峰相对强度可由(a+b)n展开式计算，式中a、b分别为该元素轻、重同位素的相对丰度，n为分子中该元素个数。在含有两个氯原子的化合物中，a=3，b=1，n=2，故(a+b)2=9+6+1，则其分子离子峰与相应同位素离子峰强度之比为9：6：1。通过对谱图中各碎片离子、亚稳离子、分子离子的化学式、m/z、相对峰高等信息分析，根据各类化合物的分裂规律，找出各碎片离子产生的途径，从而拼凑出整个分子结构。（1）α裂解：在奇电子离子中，与其相邻原子的外侧键断裂，属于该原子的一个电子转移，并与游离基中心的未成对电子形成新键，构成较稳定的碎片离子。（2）i裂解：在奇电子离子中，与正电荷中心相连的键的一对电子全被正电荷所吸引，造成单键的断裂和电荷的转移。（3）σ裂解：分子中σ键在电子轰击下失去一个电子，随后分子裂开生成碎片离子。（4）γ裂解：由自由基引发、重新组成新键而在γ位导致碎裂的过程。（5）麦氏重排：具有γ-氢原子的侧链苯、烯烃、环氧化合物、醛、酮等经过六元环状过渡态使γ-氢转移到带有正电荷的原子上，同时在α、β原子间发生裂解。（6）逆Diels-Alder（RDA）裂解：具有环己烯结构类型的化合物可发生此类裂解，一般形成一个共轭二烯正离子和一个烯烃中性碎片。仪器维护 | 液相色谱易错十大操作！
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