学习笔记 | in-vivo 细胞疗法之LNP

1. 可电离脂质

可离子化脂质是LNP中最关键的组分，决定了LNP的效力和转染效率。

• 作用：促进核酸的高效封闭和细胞内化，介导LNP膜的破坏，从而将核酸释放到细胞质中。

• 机制：可离子化脂质具有pH响应性，在生理pH下通常不带电或仅有微量正电荷，而在低pH值下会带正电荷。

• 在LNP制备的酸性环境中，脂质带正电荷，通过静电作用高效包裹带负电的核酸（如mRNA、siRNA等）

• 在血液循环的生理pH下，脂质保持中性或略带正电荷，从而降低毒性并提高LNP的生物相容性，防止与带负电的生物分子发生非特异性结合；

• 当LNP被细胞内吞进入酸性的内体后，脂质重新带正电荷，从而与带负电的内体膜相互作用融合，LNP中包裹的核酸得以逃逸到细胞质中；

• 需要注意的是，适用于mRNA的LNP配方可能并不适用于siRNA或DNA等其他载荷。

2. 磷脂

磷脂通常被称为‘辅助脂质’之一，负责构建LNP的结构和膜整合功能。

• 作用：提供结构支持和结构稳定性，形成LNP的表面膜，并协助内体膜整合。

• 机制：磷脂通常位于LNP外围，自发组织成膜结构，类似于细胞膜。

3. 胆固醇

胆固醇也是LNP必不可少的辅助脂质，通过调节膜的物理特性来提高LNP的整体性能。

• 作用：增强颗粒的稳定性和完整性，调节脂质双层的流动性，并协助内体释放。

• 机制：胆固醇可整合到脂质双层中，提高LNP的致密性，从而防止过早泄漏或颗粒分解。在脂质本应用中，胆固醇还能显著减少表面结合的血浆蛋白数量，从而改善循环半衰期。

4. 聚乙二醇化脂质（或称PEG-脂质）

PEG化脂质在LNP中通常摩尔比例最小，但对LNP的稳定性和体内行为具有决定性影响。

• 作用：赋予LNP表面亲水性，增强LNP稳定性，并防止颗粒聚集。同时提供‘隐身效应’，延长血液循环半衰期。

• 机制：PEG化脂质的结构包含亲水头部和疏水尾部，其摩尔质量范围较广，从400Da到50kDa不等。

• PEG链在LNP表面形成亲水性空间位阻屏障，帮助LNP的自组装，且每个颗粒上足够的PEG链可避免制剂出现不均一性，还能通过防止聚集来维持颗粒的稳定性；

• 提高PEG化脂质的摩尔比会导致更高的表面积与体积比，使LNP颗粒显著变小；

• PEG化脂质的疏水尾部整合到LNP膜中，脂质尾部的长短影响其从膜上解离的速度，提高LNP在生物体内的稳定性；

• PEG化脂质可限制LNP的蛋白结合与细胞吞噬，从而延长LNP在体内的循环时间，改善LNP的肝脏外蓄积；但同时，PEG化脂质提供的‘隐身效应‘会限制细胞相互作用，可能导致细胞摄取率低和内体逃逸能力差

二

LNP制造方法

LNP的合成方法，或者更广泛地说，所有基于脂质的纳米颗粒的制造方法可以归为两类：

• 自上而下法：又被称为高能法，通过施加能量将大颗粒破碎成小颗粒；

• 自下而上法：这种方法涉及脂质组分的自组装从而形成均匀的纳米颗粒系统。

图4.LNP合成和制造的现有方法

LNP的成功研发依赖于多种因素的结合，包括合适脂质的选择，它们的比例和浓度。但是，制剂过程本身也同样重要，它直接影响纳米颗粒的关键质量属性(CQA)，例如粒径、多分散指数(PDI)、封装效率、产率和形态。反之，这些CQA又在决定药品的药代动力学、细胞摄取、毒性和总体疗效方面起关键作用。

图5.制剂方法对LNP终产品CQA和特性的影响

1. LNP合成的自上而下方法

自上而下法通常是高能方法，其原理是将脂质置于高温、高压的恶劣条件下，产生高剪切应力，从而实现LNP尺寸的减小。 这些方法既可以单独制备纳米颗粒，也可以与另一种方法结合，以提纯和提高纳米颗粒的质量。一种典型的组合是将薄膜水合法与挤出机一起使用。

总体而言，这些方法的优势在于大规模应用。然而，系统中涉及的高能量可能导致脂质或核酸发生改变，因此不适用于生物领域的可持续应用。另外，它们的封装效率较低，且在小体积制剂(<毫升)方面存在困难。

• 高压均质法(HPH)

  高压均质法利用高速搅拌器制备熔化脂质、水和表面活性剂组成的乳剂。溶液在高压条件下通过小孔被高速推送。液体获得的高速会伴随湍流、高剪切力和窜货现象，使得即使在高浓度下也能形成有机纳米颗粒。

  HPH合成LNP有两种主要方法：热均质法和冷均质法。

• 冷均质法：对于冷均质法，药物-脂质熔体被冷却以形成颗粒，将这些颗粒分散在冷表面活性剂中，生成预混悬液。接着对悬液进行均化处理，使颗粒破碎并形成纳米颗粒。这种方法可最大限度减少亲水性药物向水相的扩散，能处理热敏性药物。

• 热均质法：在热均质化过程中，将药物和脂质混合物加热至熔点以上，保持该温度，同时将混合物分散到热表面活性剂中，形成热预乳液。随后对热预乳液进行均质化处理，再冷却，从而形成纳米颗粒。

• 超声均质法

  LNP也可通过超声来制备，采用些方法时，超声波会产生空化现象，导致气泡的形成和破裂，从而合成LNP。此外，引入的能量有助于破碎纳米颗粒，实现尺寸减小。尽管这种方法能够控制尺寸，但它的封装率很低，还可能导致脂质降解和金属污染。

2. LNP的自下而上方法

自下而上的方法侧重于从纳米颗粒的基本成分（如脂质或聚合物）开始，将它们组装成最终的纳米颗粒产品。这种方法包括多种技术，如薄膜水合作用或各种纳米沉淀/自组装方法。

• 薄膜水合

  薄膜水合法，又称Bangham法，是用于LNP和脂质体制备的经典技术。将脂质溶解在有机溶剂(如乙醇和氯仿)中，通过蒸发去除有机溶剂形成脂质薄膜，然后用水溶液对其进行水合以引发纳米颗粒的形成。

  薄膜水合法可制备实验室规模的LNP，且残留溶剂少、生产流程简单、成本低。

  然而，由于对其合成/混合的条件控制不佳，所制备LNP的理化性质很差，批间重复性极低，样品尺寸分散度极高，且几乎无法控制尺寸，由于这些原因，薄膜水合法通常会与高能技术相结合，如通过挤压或超声处理来减小纳米颗粒的尺寸并使其均质化，提高对所制备纳米颗粒的控制水平。

  当生产量增加时，有溶剂的用量也会增加，蒸发有机溶剂耗时较长，此外还存在封装效率低和规模化生产困难的局限性。

• 基于纳米沉淀的LNP合成方法

  基于自组装或称纳米沉淀的方法是开发新冠疫苗相关LNP的主要方法。其基本原理是将含有待封装的亲水性原料药或寡核苷酸的水相，与含有脂质的水混性溶剂（如乙醇）混合。

  当溶剂与水相混合时，其局部浓度的降低会导致脂质溶解度下降，进而触发脂质的自组装并生长形成纳米颗粒。

图6.混合时间对LNP粒径的影响

自组装过程分为4个步骤：过饱和，成核，生长，稳定或成熟。所制备的LNP，其理化特性很大程度上取决于合成条件。

最重要的因素有：

• 混合时间对生成的LNP尺寸有显著影响；混合速度越快，合成的LNP尺寸越小；

• 使用高浓度的表面活性剂或其他两亲性稳定剂，形成的纳米颗粒会减小其最终尺寸；

• 溶质浓度越高，形成的晶核数量就越多，从而增加聚集事件的发生，最终导致纳米颗粒的最终尺寸增大；

• 黏度和温度在决定纳米颗粒的最终尺寸方面发挥作用，但其影响更难准确地预测和测量。

基于溶剂的方法，主要局限性在于溶剂可能残留在最终溶液。不过，监管框架对乙醇含量来说相对灵活，FDA允许的乙醇含量高达0.5%，剩余的过量溶剂可以通过离心、切向流过滤、透析等方法轻松去除。此外，后处理纯化步骤也确保了最终药品具有更好的稳定性。

• i. 移液混合法

  移液混合法是一种快速的制剂技术，适用于小批量LNP。将含有脂质的有机溶液与含有核酸的缓冲液混合，通过移液操作快速混匀，使用多通道移液可以实现高通量的LNP制备。

  这种方法的优点包括操作简单和时间效率高。然而，该技术存在重复性差和可扩展性低的局限性，所制备的LNP多分散性强，胶体稳定性差，核酸封装效率低。

• ii. 涡旋

  与移液混合相比，涡旋混合可以快速制备小规模批次的LNPs，且减少了人工投入。在这种方法中，将缓冲溶液与脂质乙醇溶液混合，然后在涡旋混合器上以中等速度涡旋。

  这种方法在实验室规模下易于实施和操作，通常用于实验室规模的体积(100ul-4ml)。其局限性与移液混合法相似

• iii. 乙醇注入法

  乙醇注入是一种LNPs制备的常用技术，是薄膜水合法最早的替代方法之一，无需超声处理，由Batzri和Korn于1973年首次提出并开发。将脂质溶解在乙醇中，在搅拌的同时快速注入含有待封装核酸的水性溶液中，由于混合溶剂极性的增加，注入的脂质溶液会被水性缓冲液迅速稀释，从而快速形成囊泡。

  相比传统方法，错流注入法是为大规模生产而开发，在这种方法中，乙醇溶液通过一个带有错流管的装置注入缓冲液中，从而形成脂质体。

  乙醇注入法形成的LNPs的大小受脂质浓度、搅拌速率、注入速率以及所用脂质的影响。然而，其缺点是重复性差、可扩展性低及封装效率低，此外，超声处理过程可能降解脂质和药物成分，该方法未被广泛使用，

• iv. 超临界液体法(SCFs)

  SCFs法的开发旨在减少纳米沉淀过程中溶剂的使用。有多种方法可供选择，最常用的是超临界反溶剂法(SAS)，即超临界液体通过加压室，同时药物通过喷嘴喷洒在超临界液体上，当水与溶剂水合时会生成LNP。超临界二氧化碳与有机溶剂互溶，并作为溶质的反溶剂发挥作用。

  实际应用中这些方法存在重大缺陷：首先，它们只能处理可溶于超临界二氧化碳的物质，限制了应用；另外，这些方法涉及的高温高压会对原料药带来风险；再者，这些方法需要极高的投资成本和能源消耗，难以大规模实施；最后，由于其复杂性，这些方案尚未商业化。

• v. T型接头混合法

  Hirota等于1999年提出了通过T型接头混合制备的脂质基药物，与涡旋和移液等宏观混合方法相比，T型接头混合能制备出可重复且可控的载核酸脂质复合物，是商业化生产大批量mRNA-LNP的常用选择。

  T型接头通过注入两种不同的溶剂，使各入口处的溶剂相互碰撞产生湍流，从而实现快速混合。有研发表明，通过T型接头混合对流速的控制会影响纳米颗粒配方的特性。

  与传统的脂质体方法相比，该方法通常具有更高的封装效率，然而，T型接头快速混合所需的高流速在实验室规模中并不适用，更适合大规模生产。

• vi. 冲击射流混合器(IJM)

  IJM的核心是通过高压驱动的流体撞击实现脂质相与水相的快速、均匀混合，通过调控流体压力、流速、射流角度等混合参数，可精确控制LNPs的粒径、分散性和核酸封装效率，满足不同应用场景的需求。

  IJM具有显著优势，可在毫秒级时间内实现液体均匀混合，制备的LNPs粒径分布窄，批次间重复性高，可通过放大流体能量实现大规模生产，尤其适合工业级需求，新冠疫苗期间，包括Pfizer在内的多家公司将IJM用于疫苗生产。

• vii. 微流控合成LNP

  精确控制混合参数对获得均匀的LNP群体和良好的批间重复性至关重要，因此微流控技术迅速成为合成LNP的理解解决方案。

  微流控技术是一种通过微通道操控小至nL级别小体积液体的技术。在微米尺度下，液体的行为与日常不同，呈现层流状态，使得在整个合成过程中都能够精确控制液体的流动行为，并能提高体积/表面积比。此外，微流控技术能够处理极小体积的制剂，这对经济高效的筛选至关重要，使其成为RNA-LNP药物产品早期开发阶段的理想选择。

  在这种尺度下，由于液体流动的层流性，溶剂和水相的混合过程引发纳米粒子的自组装，其主要优点是可控性和可重复性极佳。

  常用的微流控混合方法有扩散法（如流动聚集）、混沌法（人字形或挡板混合器），都能提供可控流速、效率、重复性和封装效率，被认为是最先进的LNPs制备方法。

图7.LNP制造工艺对比表

三

LNP应用

mRNA-LNPs技术具有快速、灵活、高效且安全的特点，在多种疾病方面展现出巨大潜力，尤其是在流行性传染病快速响应上具有重要意义。然而，‘标准’LNPs的特性会自然吸附血液中的ApoE蛋白，导致LNPs像乳糜颗粒一样被肝脏的LDL受体捕捉吸收。

为拓展LNP技术的应用范围，如in-vivo CAR-T制备，需要实现LNPs可控的靶向递送。目前的研究主要使用3种调节手段重新定向LNPs：被动靶向、主动靶向与内源性靶向。

1. 被动靶向

被动靶向利用靶组织独特的解剖和生理特征来设计适合它们的LNPs，包括改变LNPs的粒径、电荷或形状，优化其在特定组织中的积累。例如，纳米颗粒在肿瘤组织中的累积依赖于肿瘤血管的渗透性，即渗透与滞留效应，肿瘤血管比正常血管通透性更高，允许特定大小的纳米颗粒穿过内皮细胞之间的间隙，从而在肿瘤组织中累积。

2. 主动靶向

主动靶向是指通过连接靶向配体，如抗体、抗体片段、肽、配体等，来修饰LNP的表面，这些配体与靶细胞上的特定受体结合，促进受体介导的细胞摄取。

例如最新的研究中使用双特异性抗体，而非将抗体化学键合到LNP上。抗体的一端结合LNP表面的PEG，另一端结合靶细胞上的目标分子，如T细胞的CD5分子或内皮细胞的PECAM-1。这种方法能够使用现货型LNPs，并根据靶标的不同，简单地与不同的双特异性抗体混合。

3. 内源性靶向

内源性靶向是指改变LNP的化学组成，使其能够到达体内特定组织。通过在LNP结构中添加额外的脂质成分或使用新型脂质来实现这一目标，一旦注入血液，这些改变会导致某些蛋白附着在纳米颗粒上，形成保护层，这一保护层引导纳米颗粒到达肝脏以外的特定组织，如骨髓、脾脏或肺部。

较流行的方法是，向LNPs的4种脂质配方中添加第5种选择性器官靶向(SORT)脂质，如添加一个永久带正电的脂质(如DOTAP)使LNPs特异性地递送至肺部，或添加永久带负电的SORT脂质(18PA)将其引导至脾脏。

此外，另一种已被证实能将纳米颗粒导向脾脏的策略是使用短尾脂质，有研究表明，mRNA表达会随着可电离脂质尾部长度的改变逐渐从肝脏转移到脾脏。

最新研究表明，层状脂质纳米颗粒（LLNPs）采用聚阴离子涂层（例如某些多糖或丙烯酸聚合物）代替PEG，这些涂层展现出显著的‘隐蔽’特性，使脂质纳米颗粒能够绕过肝脏，到达骨髓或肿瘤部位。

参考资料：

1. Lipid nanoparticles: Composition, formulation, and application; doi: 10.1016/j.omtm.2025.101463

2. Lipid nanoparticles for delivery of RNA therapeutics: Current status and the role of in vivo imaging; doi: 10.7150/thno.77259

3. Introduction to lipid nanoparticle manufacturing and LNP synthesis- Inside Therapeutics; https://insidetx.com/resources/reviews/lnp-synthesis-overview-of-the-manufacturing-methods/

4. Fundamentals of lipid nanoparticles formation mechanism by nanoprecipitation - Inside Therapeutics; https://insidetx.com/resources/reviews/fundamentals-of-lipid-nanoparticles-formation-mechanism/

5. The Role of Four Lipid Components of LNPs; https://www.biochempeg.com/article/362.html

6. Passive, active and endogenous organ-targeted lipid and polymer  nanoparticles for delivery of genetic drugs; doi: 10.1038/s41578-022-00529-7

7. Development of mRNA Lipid Nanoparticles: Targeting and Therapeutic Aspects; doi: 10.3390/ijms251810166

8. https://gemini.google.com/

ps：这篇文章写作时参考了大量文献，整理起来有点乱，花费时间远超预期，让我有些难受，本来应该很快把iv-vivo这个系列完成，再添加些软件类推广，看来要延后了。原计划要补充的LNP免疫原性以及质量参数部分，暂时就不写了，看看有时间了再补。

另外，查阅资料时还用到了AI工具，虽然信息获取方便了许多，但也有信息不全以及信息不准确的忧虑，从而又陷入反反复复查询验证的泥潭。更令人受挫的是，发现AI的资料整理能力与表达能力比我更好，看AI汇总信息时再看看自己写的，顿时就不好了。

总而言之，这篇关于LNP的长文算是完成了，读完后基本能对LNP有个大致的了解，更深入的探索还是要依赖于文献的阅读。

在AI辅助的时代，还是不能丢失自己的判断，个人关键技能要勤学勤练，共勉！