前篇提到，SEC-HPLC方法相对简单易行，自动化程度也高，已经成为分析抗体类药物大小异质性的两种常规方法之一。虽然分析方法简单，但是在谱图的深度解析上，有时候却需要费一番力气。例如，主峰前面出现了肩峰(pre-peak，或者shoulder），你会简单的把它当做聚体来分析吗？下面两个案例揭露了pre-peak的真面目：可能是出现了W的氧化，也可能是因为抗体上多“粘”了轻链的尺寸变异体。在日常工作中，就遇到了这样的问题。是怎么发现的呢？我们的分子在做加速稳定性实验的时候，40℃，28天样品在SEC-HPLC分析时主峰前出现了一个比例约25%的肩峰。这是一个比较严重的问题，需要深入分析。对样品进行了亚基分析和Native-SEC-MS分析，得出的结论是40℃稳定性样品中+16Da比例显著增加。而+16Da可能是出现了氧化。通过肽图分析，把常见的易氧化氨基酸M和W放进去一搜，还真是有很高比例的W氧化修饰，并且修饰位点还在CDR区。
至于这个样品在加速稳定性实验中会出现如此高比例的氧化，上游纯化同事复盘后推测可能是纯化过程中某个物料有问题，引入到了样品中，导致加速实验时氧化比例显著变高。
其实，Amgen的研究人员在2007年发表的一篇文章，使用SEC-HPLC分析就发现某抗体主峰前有肩峰的问题。经过一番深入分析，确认是W氧化引起的。而且，这是第一篇报道抗体中W氧化的文章。下图是SEC-HPLC的结果，串联了两根东曹的TSK-G3000swxl做出来的。他们是怎么发现这个峰是W氧化引起的呢？跟我们的表征方法差不多，还原亚基分析和肽图分析。
因为重链中的糖基化修饰会干扰氧化重链的分析，他们对重链进行了脱糖处理。这样，氧化的重链和未氧化的重链在分子量上能有一个较好的分离，图上可以看到29.5min处氧化的重链分子量比native的多16Da（49164vs49180），他们推测可能是氧化修饰。
接着是肽图分析，氧化的多肽峰因为极性增大比native的会提前出峰，分子量上氧化的峰比不氧化的峰也多16Da。
最后，通过MS/MS分析确认了发生氧化的是多肽中的W。其实，这篇文献对于发现抗体W氧化会引起SEC柱上的保留行为有差异并没有过多的强调，而是侧重于开发了一种RP-HPLC的方法用于定性和定量分析样品中氧化的比例，用于批次放行。
小知识
色氨酸氧化后会形成不同的产物，比如+32Da的甲酰犬尿氨酸和+4Da的犬尿氨酸。
2. 抗体上多“粘”了轻链在SEC-HPLC上出现肩峰下游同事在纯化一个双抗的时候，一步亲和下来的样品主峰前面除了二聚体峰外，在二聚体和主峰之间有一个小的肩峰，比例只有1%左右。纯化同事尝试着使用离子柱分离得到肩峰比例高的组分，其中有一个组分的比例在4%左右。
因为这个肩峰的比例较低，同事跑SDS-PAGE，NR中看到了单体的条带，而有一条很淡的轻链条带被我们漏掉了。
首先，用常规的RP-MS进行了分析，质谱上检测到了主峰和一条轻链的峰。接着，因为是SEC-HPLC发现有肩峰，尝试用SEC-native MS对这个肩峰直接进行分析。发现这个肩峰中除了完整抗体峰外，在170KD处出现了一个峰，经过一番计算，发现与在完整抗体的基础上加一条轻链和一个cys刚好对的上。这里为什么要加cys呢，是因为轻链C端的cys是游离的，会和培养基中的游离cys配对形成二硫键。
最后总结分析：SDS-PAGE和RP是一个变性的条件，非共价偶联的轻链会掉下来形成单独的一个条带或者峰；而SEC是一个native的条件，进质谱后能检测到intact+L。这个shoulder是一个完整抗体通过非共价键结合了一个轻链的杂质。
完成测试任务后，做了一下文献检索，发现在十几年前就有人对此进行了报道。研究人员在进行工艺开发的细胞株筛选过程中，发现一个问题：培养上清SEC-HPLC中主峰和二聚体峰之间有一个肩峰。而且不同产量的细胞株中这一肩峰的比例有差异，规律就是产量越高，这一肩峰的比例也越高。为了保证产量，需要选这个高产细胞株，而为了保证纯度，需要对这一杂质进行去除。而在去除这一杂质之前，也需要对其进行一下详细的表征分析。SDS-PAGE胶图分析发现肩峰中24KD处有一明显的条带，推测是轻链。同样是变性条件的NRCE-SDS，也发现除了单体的峰外，多了一个轻链的峰。而使用非变性的SEC-MALS分析时，发现肩峰中主要的物质分子量大概是176kD左右。这些数据，让研究人员推测，肩峰的成分应该是抗体单体上多了一条轻链，并且是通过非共价键连上去的。这也是为什么变性条件下就成了单体和一条轻链的原因。为了更准确的验证这一推测，他们进行了质谱分析，并且使用的是抗体表征里用到比较少的MALDI-MS。下图中绿色轨迹的峰对应的就是肩峰的质谱结果，可以看到除了主峰外，还能看到加1-3个L的峰。这也印证了他们的猜测。正如这篇文章的题目所示，他们不是聚焦于发现这个肩峰杂质本身，而是找到纯化方法把这个杂质给去除掉，优化出来的方案是疏水相互作用色谱分离这个杂质的。除了检索到这篇文章，还看到了Genentech公司研究人员发表的一篇类似的文章。有所不同的是，多余的轻链是通过共价键结合到完整抗体上的。在SEC-HPLC分析时遇到中主峰前有shoulder，SDS-PAGE和NRCE上没有异常，首先想到的可能是W的氧化，然后通过肽图进一步确认。而如果SDS-PAGE和NRCE上有异常的情况，可以使用以下过程进行推测：首先，SDS-PAGE胶图sholder峰有杂带，杂带比理论条带更大还是有多余的轻链条带，若是比理论条带大，可能是共价结合了轻链一类的片段；若是有多余的轻链条带，则可能是通过非共价键结合到完整抗体上的；其次，使用液质来确认上一步的判断，若RP-MS中看到的直接是intact+L，则是共价键结合了轻链；若看到的是intact和单独的轻链峰，则是通过非共价键结合的；再次，对于通过非共价键结合轻链的轻链，可以通过SEC-MS进一步确认这一情况，使证据更确凿。最后，对于单体共价结合轻链的情况，使用万金油肽图分析，确认共价结合轻链的方式，是怎样的二硫键错配引起的。1. Analytical characterization of a monoclonal antibody therapeutic reveals a three-light chain species that is efficiently removed using hydrophobic interaction chromatography. 2. Characterization of monoclonal antibody size variants containing extra light chains3. Yang J, Wang S, Liu J, Raghani A. Determination of tryptophan oxidation of monoclonal antibody by reversed phase high performance liquid chromatography.
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