基因工程学习笔记(1)原核基因组文库构建:线性化质粒DNA脱磷酸化处理的意义

一、核心意义
       防止线性化质粒载体自身重新环化，提高目的DNA片段与载体的连接效率，提升阳性重组子的筛选比例。
二、具体解释
      1. 质粒经限制性内切酶切割后，两端形成黏性末端或平末端，极易发生自身连接，重新环化为空载质粒。
      2. 经碱性磷酸酶脱磷酸化处理后，质粒两端5′端的磷酸基团被去除，其末端无法形成磷酸二酯键，从而不能自身环化。
      3. 外源目的基因片段仍保留磷酸基团，可与脱磷酸化的质粒末端正常连接。
       4. 连接产物会形成带有单链缺刻的环状DNA分子。缺刻产生的原因是载体两端没有磷酸，只能各连一条链，另一条链有缺口。该分子可正常转化受体菌，并在宿主细胞内通过修复系统补齐缺刻，最终形成完整的重组质粒。